Святитель Митрофан родился 6 ноября 1623 года в селе Антилохово Владимирской губернии (ныне Савинский район Ивановской области) в семье священника Василия и Марии. При крещении он был наречен именем Михаил. В синодике, принадлежавшем святителю, перечень имен начинается с лиц, облеченных в священнический сан, и это дает основание полагать, что он происходил из рода потомственных священников. Из духовного завещания святителя Митрофана известно, что он «родился от благочестивых родителей и воспитан ими в непорочном благочестии Восточной Церкви, в православной вере». До сорокалетнего возраста жил в миру: был женат, имел сына Иоанна и служил приходским священником. Местом пастырского служения иерея Михаила был храм Рождества Иоанна Предтечи в селе Сидоровском (ныне Ивановский район Ивановской области), расположенном у реки Молохты, притока Тезы, впадающей в Клязьму, недалеко от города Шуи (ныне Владимирская область). На сороковом году жизни лишившись супруги, в 1663 году священник Михаил принял постриг с именем Митрофан в Золотниковской пустыни недалеко от города Суздаля. В синодике обители запись рода святителя Митрофана начинается словами: «Род черного священника Митрофана Сидоровского». Через три года иноческой жизни иеромонах Митрофан был возведен в сан игумена Яхромской Косминой обители. Этим монастырем он управлял 10 лет, проявив себя усердным настоятелем. Его заботами здесь был воздвигнут храм в честь Нерукотворного Образа Всемилостивого Спаса. Патриарх Иоаким (1674–1690), узнав о высоком благочестии святого Митрофана, возвел его в 1675 году в сан архимандрита знаменитого в то время Макариево-Унженского монастыря. Там попечением святого был сооружен храм в честь Благовещения Пресвятой Богородицы с трапезной и колокольней. На Московском Соборе 1681–1682 годов в целях борьбы со старообрядческим расколом и улучшения христианского просвещения среди православного населения было решено увеличить число епархий и открыть новые кафедры: Воронежскую, Тамбовскую, Холмогорскую и Великоустюжскую. Святитель Митрофан был вызван в столицу и 2 апреля 1682 года рукоположен во епископа Воронежского Патриархом Иоакимом и шестнадцатью архипастырями. Святителю от роду было тогда 58 лет. После своей хиротонии епископ Митрофан прожил продолжительное время в Москве – с апреля до половины августа. 28 апреля скончался благочестивый царь Федор Алексеевич, а 25 июня епископ Митрофан участвовал в венчании на царство юных государей – Иоанна и Петра Алексеевичей. Начало епископского служения святителя Митрофана совпало с тяжким для Руси временем смут и церковного раскола. Святителю Митрофану пришлось быть свидетелем бунта раскольников и присутствовать на «прении о вере» между старообрядцами и православными в Грановитой палате. Это событие произвело на него сильное впечатление. Не случайно святитель Митрофан приобрел известность как обличитель раскола и сподвижник патриотических начинаний царя-реформатора. Первый Воронежский Архипастырь рассматривал духовенство как силу, способную воздействовать на население самым благотворным образом. По прибытии в Воронеж святитель Митрофан начал архипастырскую деятельность с постройки нового кафедрального собора в честь Благовещения Пресвятой Богородицы взамен ветхого деревянного храма. В 1692 году собор с приделами во имя Архистратига Михаила и святителя Николая был освящен. За 20 лет служения святителя Митрофана на Воронежской кафедре число храмов в епархии возросло с 182 до 239, было основано два монастыря: Коротоякский Вознесенский и Битюгский Троицкий. Большое внимание Архипастырь уделял искоренению нестроений и беспорядков в монастырях и утверждению в них строгой жизни по иноческому уставу. Первый Воронежский святитель ревностно заботился о нуждах паствы. Он утешал бедных и богатых, был покровителем вдов и сирот, заступником обиженных. Его дом служил гостиницей для странников и лечебницей для больных. Он усердно молился и о живых, и об усопших христианах, особенно о воинах, павших за Отечество, вписывая их имена в свой синодик. Поминая их за проскомидией, святитель Митрофан говорил: «Аще праведна душа, то большей части сподоблена бывает, аще ли грешна, то будет причастница милости Божией». Известно о большой дружбе, связывавшей святителя Митрофана со святителем Питиримом, епископом Тамбовским. Они не только поддерживали переписку, но и встречались для духовных бесед. История основания близ Тамбова Трегуляевского Иоанно-Предтеченского монастыря связана с их дружескими отношениями. 15 сентября 1688 года святитель Митрофан посетил святителя Питирима. Втроем (с ними был священник Василий) они совершили прогулку в места уединенных молитв Тамбовского Архипастыря и избрали место для будущей обители.
Святитель Митрофан, как человек высокого патриотизма, своим нравственным авторитетом, благотворительностью и молитвами содействовал преобразованиям Петра I, необходимость и цель которых хорошо понимал. При постройке в Воронеже флота для похода на Азов он убеждал народ всемерно помогать русскому самодержцу. Это было особенно важно, ибо многие считали устройство флота делом бесполезным. Святитель не ограничивался только советами царю, но и оказывал материальную поддержку государственной казне, нуждавшейся в деньгах для строительства флота. Патриотические чувства епископа Митрофана соединялись с непоколебимой верой и строгостью православных убеждений, ради которых он не боялся навлечь на себя и царский гнев. Святитель отказался идти во дворец к Петру I, увидев там статуи языческих богов, и остался непреклонен, хотя за ослушание царской воле ему грозила смерть. Государь приказал убрать статуи и с того времени проникся еще большим уважением к Архипастырю. Скончался святитель Митрофан 23 ноября / 6 декабря 1703 года, в глубокой старости, приняв перед смертью схиму с именем Макарий. Погребение совершено было 4/17 декабря в Благовещенском соборе города Воронежа с большими почестями. Царь Петр I сам нес гроб святителя от собора до усыпальницы. Прощаясь, он сказал: «Не осталось у меня больше такого святого старца. Ему же буди вечная память». Эти справедливые слова любви и благодарности в устах труженика-царя были лучшей речью над могилой труженика-святителя. Царя и епископа связывала любовь к Отечеству, и оба они, хотя и на разных путях, трудились на благо дорогой Родины. Память о глубоком благочестии и пастырских добродетелях святителя Митрофана свято чтима была в Воронеже со времени его кончины. Преемники его считали священным долгом ежегодно творить поминовение по Первосвятителю своей паствы и его родителям, иерею Василию и Марии. С 1820 года число почитателей молитвенной памяти святителя Митрофана особенно возросло, при соборе начали появляться записи о чудесах на его гробнице. Архиепископ Воронежский Антоний (Смирницкий) неоднократно докладывал Святейшему Синоду о чудесных исцелениях на месте упокоения первого Воронежского Архипастыря, испрашивая разрешение на прославление святителя. В 1831 году последовало официальное донесение об этом Синоду, по решению которого 7 августа 1832 года состоялось торжественное открытие гроба, а затем последовала канонизация святителя. От его святых мощей по милости Божией происходили многочисленные исцеления страждущих телесными и душевными недугами, одержимых, расслабленных. В 1836 году при Благовещенском соборе в Воронеже был учрежден Благовещенский Митрофанов монастырь, в котором пребывали мощи Воронежского первопрестольника. В 1929 году святые мощи святителя Митрофана были кощунственно изъяты из Благовещенского собора, и только в 1964 году милостью Божией произошло их возвращение в Церковь. А 16 сентября 1989 года честные мощи первого епископа Воронежского были торжественно перенесены в Покровский кафедральный собор. Святитель Митрофан вернулся к своему словесному стаду.
Ныне мощи святителя Митрофана пребывают в Благовещенском кафедральном соборе Воронежа, подавая великое утешение и помощь всем, с верой к ним притекающим. Известны многие случаи совершающихся у раки честных мощей чудотворений, имеется множество свидетельств о благодатной помощи. Ежедневно в соборе служатся молебны с акафистом святителю Церкви Христовой и Небесному покровителю града Воронежа и всей паствы Воронежской митрополии. Память святителя Митрофана совершается: 23 ноября (6 декабря н. ст.) – день преставления (1703); 19 июля (1 августа н. ст.) – вместе со святителем Димитрием, митрополитом Ростовским, и святителем Тихоном, епископом Воронежским; 7 (20 н. ст.) августа – обретение мощей (1832); 4 (17 нов. ст.) сентября – второе обретение (1964) и перенесение мощей (1989).